〈研之有物〉香蕉也有身分證！找到抗黃葉病品種的DNA特徵 保護台蕉專利權
抗黃葉病品種的分子標誌
「以前只會吃香蕉，不會特別關心香蕉。」中研院農業生物科技研究中心陳荷明副研究員，過去研究主題無關香蕉，也沒有想過自己有一天會研究香蕉，但有鑑於香蕉黃葉病影響甚鉅，加入了研究的行列。她帶領團隊運用基因序列資料分析，找到鑑定台灣抗黃葉病香蕉品種的分子標誌，保障台灣香蕉的品種專利權。跟著研之有物一起來了解！
處處買得到的香蕉，好吃、便宜又很方便，剝開皮就可以吃，兩三口就吞下肚，因為果肉裡沒有籽，不需要一邊吃一邊吐籽…… 等等！你有沒有想過：香蕉沒有籽，怎麼繁衍下一代？
香蕉，其實有籽……
切開香蕉，果肉中軸附近有一些黑點，有些比較明顯，有些幾不可見。這些黑點正是香蕉已退化或發育不良的種子。因為市面上的食用香蕉大多是三倍體，也就是有三套染色體的華蕉。三倍體的香蕉會開花、會結出果實，但沒辦法發育出正常的種子。
人類是二倍體，有兩套染色體，一套來自父親、一套來自母親。像香蕉這樣染色體超過兩套的，稱為「多倍體」，這在動物界很少見，在植物界卻相當普遍，像小麥是六倍體，草莓則是八倍體。由於多倍體結的果實通常比較大，而且相較於二倍體來說，有更多染色體可儲存基因，具備比較多樣的性狀，在農業上有許多應用價值。而且三倍體的香蕉種子會退化，能讓果肉吃起來柔軟滑順。
沒有種子，怎麼繁殖？香蕉採用「營養繁殖」，利用從塊莖冒出來的「吸芽」產生新的植株。栽種時，農民可直接挖取母株旁邊由吸芽發育長成的小香蕉樹，移植到另外的田地上，或是向蕉苗場購買利用組織培養產生出來的香蕉苗。無論用哪一種方式栽種，母株和子株的基因幾乎是一樣的，保障香蕉的優良品種。
但，保留品種的反面，即缺乏基因多樣性。一旦現存品種對於某種疾病沒有抵抗力，即將面臨全面性的滅種危機……
黃葉病：香蕉的瘟疫
香蕉大滅絕，沒有香蕉吃——這可不是危言聳聽，而是真實發生過。一百多年前中南美洲主要栽種的香蕉品種是「大米七」，雖然外皮比較厚，但是香氣濃郁，果肉超甜，據說比現在的華蕉更美味。1900 ～ 1960 年間，香蕉黃葉病肆虐，導致大米七幾近滅絕。
香蕉黃葉病又稱「巴拿馬病」，是一種叫做「尖孢鐮刀菌古巴專化型」的真菌所引起，這種真菌能以 (厚壁) 孢子的型態在土壤裡存活超過三十年，經由土壤、灌溉水或附著在農具或車輛上，四處傳播、感染栽種在田裡的香蕉。罹病的香蕉會由下方老葉葉緣先黃化，然後逐漸擴大，最後整株枯萎死亡。罹病的香蕉植株如果隨意丟棄，也會傳播病菌，難以防治。
所幸，後來可抗黃葉病的華蕉取代了大米七，成為目前全世界主要栽種的品種，人們才又有香蕉可以吃，臺灣的主力品種「北蕉」就是屬於華蕉。
然而，黃葉病的威脅並沒有遠離。1967 年台灣屏東縣佳冬地區的蕉園首次出現熱帶第四型黃葉病，罪魁禍首是尖孢鐮刀菌古巴專化型的第四型生理小種。華蕉雖然可以抵抗舊型的黃葉病，卻無法抵抗這種新型黃葉病。1990 年代，新型黃葉病繼續入侵東南亞，2013 年證實已入侵南亞、中東、非洲及澳洲的香蕉園！
香蕉研究所，培育抗黃葉病品種
至此，全世界無不想辦法拯救香蕉的滅種危機，其中包括培育能抵抗新型黃葉病的香蕉新種，例如：台灣香蕉研究所培育的寶島蕉（又稱台蕉四號）、台蕉五號和七號，其中台蕉五號在台灣、寶島蕉在菲律賓皆已有商品化，除了抗病，也直接有經濟產值。一旦華蕉全面性的毀滅降臨時，這些可抗新型黃葉病的品種將會成為蕉農的救星。因為尖孢鐮刀菌很難用殺真菌劑殺死，又能潛藏在土壤中數十年，難以從田地中清除，改種抗病品種可說是解除黃葉病威脅最好的策略之一。
問題來了！未來如果將抗病品種推廣到其他國家，必須防範別的國家買了少量香蕉幼苗後，利用組織培養大量盜用。但過往作物多由植株或果實的外型做為分類，不容易分辨，爭議時也較難舉證。
為此，陳荷明研究團隊發揮基因序列資料分析的專長，找到了寶島蕉、台蕉五號和七號 DNA 上特殊的序列，一旦有人盜用，就能從這些獨特的 DNA 序列，也就是分子標誌，鑑定出該品種是否源自台灣香蕉研究所。
香蕉的身分證：具專一性的分子標誌
想要正確區隔出品種，分子標誌必須有專一性，以達到可信任的辨別度。陳荷明的研究團隊先把香蕉會表現的基因定序出來，利用電腦程式比對北蕉和抗病品種，找出哪些 DNA 序列不一樣，將有差異的序列一個個挑出來，進一步比對各個品種之間的差別，從中選出單一品種特有的分子標誌，作為鑑定品種的依據。
找到各個品種特有的分子標誌之後，陳荷明的團隊開發出兩種鑑定分子標誌的方法。
方法一：使用限制內切酶切割特定 DNA 片段。限制內切酶可與特定的 DNA 序列結合，將序列從中間切斷。它的專一性很高，如果序列有一點點不一樣，它就沒辦法結合、切斷序列。再用電泳法分離切割後的 DNA 片段，片段越小跑得越遠，如此一來，從電泳圖上條帶的數量和位置即可鑑定品種。
實際做法是：挑選一個 DNA 片段，如果受測基因序列屬於一般北蕉（不抗新型黃葉病），片段會被切斷，電泳會出現兩條線（代表被切斷後兩個較小片段）。如果這段基因序列屬於抗新型黃葉病的台蕉（如寶島蕉），片段無法被切斷，就會多出一條代表完整片段的線。這種方法費用相對便宜，而且不到三個小時就能知道結果。但不是所有找到的品種特有序列，皆能找到適當的限制內切酶來分辨。
方法二：經由聚合酶連鎖反應大量複製分子標誌的 DNA 片段，然後以「桑格定序法」（Sanger sequencing），進行專一性片段的定序。簡言之，桑格定序能直接檢測出 DNA 片段上 ATCG 四種鹼基的排列順序（一般交由提供定序服務的廠商處理），檢查序列上特定位置是否有變異，就可以確認品種。
桑格定序法費用較高，定序時間比較久，但準確性高，目前陳荷明提供香蕉研究所的品種特有分子標誌，都能以桑格定序來檢測。
創新的檢驗方式，研發開端可謂篳路藍縷，除了要整合多種現有序列分析工具，嘗試不同參數設定，甚至得自行編寫程式！由於要比對的序列非常龐大，沒辦法用人工逐一比對，必須靠電腦運算。不是資訊背景出身的研究助理侯博瀚，自學程式設計，編寫程式比較北蕉與抗病品種間序列差異，實驗才能進行。之後，博士後江明豪和研究助理蘇柏諺針對找到的北蕉與台蕉差異序列，以多個在地及國際常見香蕉品種，進行廣泛地測試，終於驗證分子標誌的專一性。
那麼，陳荷明團隊的下一步呢？「既然找到抗病品種的特殊序列，是否能從其中找到抗黃葉病的基因呢？」事實上，確認抗病品種的分子標誌來區分香蕉品種，只是最基礎的工作。陳荷明和許多與黃葉病對抗的科學家正分頭努力，最終希望找到香蕉抗黃葉病的基因，掌握抗病的機制，幫助香蕉擊退黃葉病，讓蕉農有香蕉可種，民眾永遠有美味又方便的香蕉可享用。
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香蕉也有身分證！找到抗黃葉病品種的 DNA 特徵，保護台蕉專利權
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