〈研之有物〉熟悉的陌生人:做麵包、釀酒以外,臺灣森林無所不在的野生釀酒酵母菌
臺灣野生釀酒酵母多樣性研究
釀酒酵母,一種被人類廣泛利用的微生物,釀酒、做麵包都會用到,此外也被大量用於科學研究。可以說不論在食品或學術上,釀酒酵母早已進入你我的生活。然而,釀酒酵母除了人類常用菌株(strain)是來自原有已知的幾個馴化譜系(domesticated lineage)之外,其實還有非常多野生譜系不為人知。中央研究院「研之有物」專訪院內生物多樣性研究中心蔡怡陞副研究員,他與研究團隊尋覓臺灣野生的釀酒酵母,意外發現臺灣島的面積雖然相比之下較小,野生釀酒酵母的遺傳多樣性卻是世界最高!論文已於 2022 年 3 月 31 日發表於《基因組研究》(Genome Research)。
釀酒、做麵包都不可或缺的釀酒酵母
釀酒酵母的學名叫作 Saccharomyces cerevisiae(簡稱 S. cerevisiae),它在釀酒或烘焙等食品業中最具代表性,也是最常見的模式生物之一。釀酒酵母作為單細胞真核生物的代表,大量用於學術研究,蔡怡陞團隊的成果即是一例。
至於釀酒酵母的產業應用,例如常見的愛爾(Ale)與拉格(Lager)啤酒來說,前者發酵溫度在 20℃ 左右,菌株就是上述的 S. cerevisiae,味道較濃郁;後者的特色是低溫發酵 10℃ 左右,菌株是人類特別選殖的雜交品系(註 1),味道較清爽。
有趣的是,世界各地的人、歷史與文化也許有別,愛酒的心卻都一樣,歐洲培育出發酵啤酒的品系,日本也獨立馴化獲得釀造清酒的酵母菌。
除了釀酒之外,製作麵包也需要釀酒酵母,故 S. cerevisiae 也稱作麵包酵母。仰賴小規模手工業的古時候,麵包師都有自己的獨家酵母,師傅教徒弟時,傳承的不只技術,也包括酵母麵團。邁入近代社會以後,各行各業都走向標準化,釀酒酵母也不例外。如今不同麵包師大都使用同一種量產酵母。
啤酒與麵包這些案例鮮活地說明,釀酒酵母深受人類影響,這也是大部分酵母菌演化研究關注的主題。然而蔡怡陞實驗室則不同,他關心的對象是處於人類影響以外、還沒有被馴化的野生釀酒酵母們。這些野生釀酒酵母們和食品業常用的菌株是同一物種(species),學名都是 S. cerevisiae,但是為不同菌株(strain)。
由於釀酒酵母的產業運用和微觀機制探討已經相當成熟,但是人們對於釀酒酵母在生態中的角色依然所知有限,以前人們甚至懷疑過,真的有野生的釀酒酵母嗎?後來才知道不但有,而且多樣性還不小,與人類密切接觸的只是少數幾款。那麼,蔡怡陞團隊是如何找出低調的臺灣野生釀酒酵母呢?
尋覓臺灣野生的釀酒酵母,低調卻無所不在
蔡怡陞過去就對酵母菌相當有興趣,因為這是他在倫敦帝國學院就讀博士班的起家主題!當時他研究的是釀酒酵母最近的親戚 Saccharomyces paradoxus。
回到中研院後,他決定在臺灣再度開啟野生釀酒酵母的研究,與博士生李佳燁、助理劉育菁、柳韋安等人多年奮鬥後,有了出乎意料的發現!如今回首 6 年來的探索過程,並不容易。
要研究野生的釀酒酵母,第一步當然是去野外採集,可是人的眼睛看不見酵母菌,所以沒辦法用視覺辨識直接採樣,要把樣本帶回實驗室,初步處理後浸入培養液,等待兩個星期才能得知結果:釀酒酵母是否存在。
實驗室使用特製培養液,有利於釀酒酵母生長,不利其他微生物。理想上,即使釀酒酵母原本的存在感很低,也能在培養液中放大。
假如等待一段時間後,培養液長不出酵母菌, 也許是一開始就真的沒有,但是有沒有可能是因為採樣和培養時有缺失,害得酵母菌長不出來?或是釀酒酵母確實存在,卻由於數量太少而無法見到?
蔡怡陞回憶,開始這項計畫的第一年,幾乎一無所獲。根據歐洲與美洲的研究經驗,野生釀酒酵母常常於橡樹表面生長,橡樹屬於殼斗科植物,所以一開始多半以市區外圍森林,如殼斗科的樹皮為目標,卻不斷失敗。
後來往更廣的範圍採樣,並與生多中心研究人員鍾國芳、黃仁磐等實驗室合作,這才克服難關,順利從多種植物的果實、樹葉、樹幹、地面、甚至是地衣等來源獲得酵母菌,並且訝異地得知,釀酒酵母在臺灣的森林其實非常普遍。
蔡怡陞歸納出的模式是:臺灣野外森林中,釀酒酵母普遍存在,但是比例非常低,可謂低調卻無所不在。
如何歸納出以上結論呢?這要利用如今基因體學的新工具:總體基因體學(metagenomic)。原理是取得環境樣本後,直接定序其中所有 DNA 片段,或是所有物種都有的擴增子(amplicon),再與資料庫對照;如此一來,便能估計目標佔整體的比例,蔡怡陞團隊就是去估算釀酒酵母佔其生長環境中的比例。
從環境採樣培養出釀酒酵母以後,由中研院定序核心實驗室的呂美曄,回頭定序該樣本的擴增子,接著由蔡怡陞實驗室的林渝非分析。野外採集的樣本中,絕大部分是細菌,通常高達至少 99% 之多;剩下多半為真菌(和原生生物等等),其中只有極低比例是釀酒酵母,最多也只佔 0.012%。因此同樣是細菌、真菌等微生物,釀酒酵母的存在感是低於 1% 中的 0.012% 以下,換句話說,不超過百萬分之 12!
透過總體基因體學的分析,能夠量化釀酒酵母在天然環境下的存在感。蔡怡陞也強調培養液很重要,否則無法讓低調的酵母菌現形。抓到目標後就能分離酵母菌,培育建立新的菌株,並且經由團隊成員李昕翰、柯惠棉的定序、組裝獲得完整的基因組。藉此獲得一百多個臺灣各地的菌株及其遺傳訊息,用於進一步研究。
釀酒酵母多樣性,臺灣竟然世界最複雜?
要了解蔡怡陞實驗室新論文的意義,必須先認識別人過去的研究。
2018 年就有研究者從世界各地收集超過一千個釀酒酵母品系,探討親緣關係。分析發現野生釀酒酵母們彼此的變化差異還不小,東亞的中國為最多變之處;將所有酵母菌擺在一起畫演化樹,中國採集到的品系能歸類到不同譜系(lineages),包括與同類最早分家,差異最大的譜系。
演化樹是一種建構親緣關係的工具,所有樣本中,兩個樣本假如有最近的共同祖先,通常遺傳上的差異也會愈少,便會被歸類到一塊;這一批和其次相近的另一批樣本們,又會被歸類到一群,就這樣一直向前回溯(見下圖),形成看似樹狀的關係。而這棵樹上愈早分離的譜系,也就代表差異愈大,愈早和其他樣本分家。
中國採集的釀酒酵母們,不但有些被歸類到較晚分家的不同群,幾個樣本更自成一群,形成最早分出的演化樹枝。這些證據有力地支持:中國是釀酒酵母的起源地。然而,案情並不單純!
將臺灣的一百多個菌株擺進演化樹,驚奇的事發生了!臺灣存在的釀酒酵母們,竟然也被歸類進各大譜系,並有新的譜系,這表示臺灣的釀酒酵母多樣性,和中國一樣高。而且還有一款進入之前於中國採集到,與同類最早分家的那一群。
驚奇之處在於,擺在全世界的尺度下看,臺灣只是一個很小的島,地處東亞大陸邊緣。中國面積龐大,釀酒酵母具備全世界最高的多樣性並不意外,也被認為很可能是發源地;可是小小的臺灣,竟然也存在一樣高的複雜度。
有沒有可能臺灣多變的品系,並非起源自當地,而是被人類無意間帶來的呢?應該不可能,因為根據遺傳差異估計,那些野生譜系們分家後衍生的年代,都早於人類在附近活動的時間;由此可以推論,目前的分佈狀況,非常可能是自然傳播的結果(或許是隨著殼斗科森林)。
所以我們可以說,臺灣是釀酒酵母最初的起源地嗎?不行。符合已知證據,比較合理的解釋是,釀酒酵母於東亞發跡,所以在東亞地區的遺傳多樣性也最高;而臺灣也包含於此一交流範圍之內,從最早的始祖開始,從古至今逐漸分家的釀酒酵母們,可能陸續,或是在同一段交流時期進入臺灣,一直低調默默生存到現在,仍保持原鄉的面貌。
然而,好的研究不只要知道有多少已知,更要知道還有多少未知。蔡怡陞提醒我們,目前研究有個盲區:東南亞地區的取樣仍十分有限。根據已知的樣本,最早與同類分家的酵母菌,它們的後裔位於中國和臺灣,故推論東亞地區是起源地。可是取樣匱乏的東南亞,會不會住著更早分家前輩的後裔呢?這是目前無法回答的問題。
在人類的世界之外,野生釀酒酵母的生殖、生態學
總之根據現有的資訊,臺灣釀酒酵母的多樣性在同樣尺度下比較確實為世界最高。大量取樣下還能觀察到,距離非常近的採集地點,竟然同時住著遺傳上差異很大,不同譜系的菌株(甚至在同一棵樹!)。相比之下,中國酵母的多樣性也高,但是分佈並不密集,相近的地理範圍內通常存在遺傳上類似的菌株。
不同研究的手法不同,這會不會是中國研究者採集較為稀疏,取樣方式導致的偏誤呢?蔡怡陞表示,的確無法排除前述可能性;但是他反而認為過去的採集方式,說不定都忽略了微生物近距離的分佈與多樣性,所以更需要反思過往認知微生物的生物地理關係。不過他也認為中國的釀酒酵母確實住的比較分散;因此差異大的品系住在附近這回事,搞不好真的是臺灣特色,至少是率先在臺灣觀察到。
另一件有趣的發現是遺傳交流。釀酒酵母是單細胞真核生物,實驗室環境下可以無性生殖,自己複製自己;也可以隨時切換成有性生殖,和同類一起生寶寶。利用菌株間的遺傳差異,可以預測自然界的釀酒酵母,大部分時候採行無性生殖(這是蔡怡陞博士班時期努力的主題!)。
既然臺灣存在許多遺傳有別的野生品系,有時候又住的很近,它們之間會遺傳交流嗎?比對基因組得知,會,不過不常見,大約每幾百到幾萬次無性生殖才有 1 次有性生殖。這證實蔡怡陞對酵母菌生殖的推論,替釀酒酵母生態學新添一分認識。
找到野生釀酒酵母之後…?
有趣歸有趣,但是研究臺灣野生釀酒酵母有什麼意義呢?
從學術上來說,蔡怡陞指出,臺灣生態系複雜,本次透過基因體學手法得到量化證據,支持釀酒酵母這種微生物,在臺灣的多樣性很高。這項在臺灣採樣的本土研究,也大幅增進全世界對釀酒酵母的認識,並可更進一步開始探討釀酒酵母在自然界所扮演的角色。從產業上來說,在蔡怡陞團隊的辛苦調查與記錄之後,未來我們是否可以期待廠商用臺灣在地的野生釀酒酵母做啤酒呢?
釀酒酵母是與人類互動最密切的微生物之一,但是人們對野生的釀酒酵母了解卻很有限,可謂無比熟悉的陌生人。蔡怡陞採集到眾多野生的菌株品系,不論學術研究或產業應用,都可能有進一步發展。目前實驗室正在把這些菌株「帶」回實驗室,開始量化相關的表現型(phenotypes)。等到時機成熟,他歡迎各界合作,一起探索臺灣自然資源的潛力。
註 1:拉格啤酒採用的菌株是 Saccharomyces pastorianus,為 S. cerevisiae 及 S. eubayanus 兩者雜交而成。
原文連結:
熟悉的陌生人:做麵包、釀酒以外,臺灣森林無所不在的野生釀酒酵母菌
延伸閱讀:
- 蔡怡陞(2017)。〈多樣性決定味覺豐富度,釀酒酵母的「萬年傳統全新感受」〉,《環境資訊中心》。
- Lee, T. J., Liu, Y.-C., Liu, W.-A., et al. (2022). Extensive sampling of Saccharomyces cerevisiae in Taiwan reveals ecology and evolution of predomesticated lineages. Genome Research.
- Peter, J., De Chiara, M., Friedrich, A. et al. (2018). Genome evolution across 1,011 Saccharomyces cerevisiae isolates. Nature, 556, 339–344.
- Duan, S. F., Han, P. J., Wang, Q. M. et al. (2018). The origin and adaptive evolution of domesticated populations of yeast from Far East Asia. Nat Commun, 9, 2690.
- White, C., & Zainasheff, J. (2010). Yeast: The Practical Guide to Beer Fermentation. Brewers Publications.
- Tsai, I. J., Bensasson, D., Burt, A., & Koufopanou, V. (2008). Population genomics of the wild yeast Saccharomyces paradoxus: Quantifying the life cycle. PNAS, 105(12), 4957–4962.